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COVID-19的治療 清冠一號與配方

國家中醫藥研究所蘇奕彰所長表示，「臺灣清冠一號」係以明代《攝生眾妙方》所輯之「荊防敗毒散」為處方基礎。

原方由「荊芥」、「防風」、「柴胡」、「茯苓」、「桔梗」、「川芎」、「羌活」、「獨活」、「枳殼」、「甘草」、「生薑」等量組成

清冠一號於2020年5月份由專利技轉團隊公告招標，陸續完成多家中藥廠的非專屬授權，包括順天堂藥廠、莊松榮、勸奉堂、立康生物、天一藥廠、漢聖製藥、勝昌製藥及華陀扶元堂等多家台灣廠商聯合發展。

三軍總醫院和台中榮民綜合醫院是台灣疾病控制中心指定的52例重症COVID-19病例反應和隔離醫院之一。在2020年1月至2020年4月之間，有35名患者被送入兩個醫療中心。他們接受了對症治療和/或羥氯喹治療，直到其中13名患者在自願的基礎上並在護理小組的同意下轉為NRICM101。

清冠一號藥方  一日服用三次，一次 100 CC，飯後 30 分後服用，直到出院。。

黃芩    五錢

魚腥草  五錢

栝蔞實  五錢

北板藍根    五錢

厚朴    三錢

薄荷    三錢

荊芥    三錢

桑葉    三錢

防風    二錢

炙甘草  二錢

以上藥材以1000毫升水煮沸濃縮至300毫升。此為單一成人患者的每日劑量。

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以下為  翻譯為中文 文獻資料

通過多種途徑靶向COVID-19的中藥配方NRICM101：臨床研究

作者鏈接打開覆蓋面板蔡常昌^b黃宜家^C嘉慶廖^一種Chia-ITsai^d邱春堂^一種林建中^C文奇威^一種晴瑞山林^C曾玉慧^一種葉國明^Ë林依玲^F佳人^G梁建鐘^F春車L^F邱文飛^一種姚浩浩^一種李申明^H李明永^一世蘇宜昌^j

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https://doi.org/10.1016/j.biopha.2020.111037獲取權利和內容

強調

•

基於草藥的配方可為COVID-19患者帶來積極的臨床效果。

•

該配方可在抗病毒和炎性試驗中抑制SARS-CoV-2的發病機理。

•

真實世界的證據可為藥物開發提供見識。

•

從床到床的方法縮短了尋找有效療法所需的時間。

摘要

截至2020年11月11日，COVID-19已成為全球大流行病，已確診的病例超過5000萬，死亡120萬。迄今為止，建議不要使用任何療法或疫苗來治療或預防新的冠狀病毒。自2020年4月起，已向台灣的COVID-19患者使用了一種新型的中藥配方“台灣清冠一號”（NRICM101），並對其臨床療效和藥理作用進行了評估。在兩個醫療中心收治的33例確診為COVID-19的患者中， = 12）年齡較大，病情較重，並存病且住院21天后仍無改善的患者被給予NRICM101。他們在9天內的中值連續獲得了3次陰性結果，並且未報告不良事件。藥理分析證明了該配方在抑制刺突蛋白/ ACE2相互作用，3CL蛋白酶活性，病毒斑形成以及細胞因子白介素（IL）-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α產生方面的作用。這項從床到床的研究表明，NRICM101可能通過其抗病毒和抗炎特性破壞疾病的進展，有望成為預防和治療COVID-19的多靶點藥物。

圖形概要

關鍵字詞

SARS-CoV-2

中藥

NRICM101

穗蛋白

3CL蛋白酶

細胞因子風暴

1.簡介

自世界衛生組織宣布嚴重急性呼吸系統綜合症冠狀病毒2（SARS-CoV-2）爆發成為國際關注的突發公共衛生事件以來的第十一個月，該病毒已感染了超過5000萬人，並奪去了120萬人的生命。全球科學界正在以前所未有的速度加快開發有效的治療方法。但是，新療法的療效尚無定論[3]，並且已經停止了重新用途的藥物（例如羥氯喹和洛匹那韋/利托那韋）的臨床試驗。在這種情況下，迫切需要採用非常規方法。同情使用未經授權的藥物[4]，現實世界研究和傳統醫學可能會提供獨特的見識，為科學研究和實證研究提供信息，從而解決對健康，經濟和社會造成嚴重影響的全球危機。

台灣於2020年1月21日報告了首例2019年冠狀病毒病（COVID-19）。其積極的公共衛生措施和強大的醫療保健系統導致病例量相對較小[5]。治療主要是對症治療，使用羥氯喹導致一些患者出現持續性高燒心律不齊或心律不齊。在指定應對COVID-19的醫療中心中，對一些仍留在隔離病房而無任何改善的患者，進行了台灣清冠義和（NRICM101）的治療，這是由內部中醫部門規定和配製的中藥（TCM）配方。國立中醫藥研究院（NRICM）在評估臨床症狀，具有相應適應症的草藥以及2003年SARS爆發之前的經驗後，提出了針對病毒性呼吸道感染和免疫調節的植物性配方[6，7]。台灣國家衛生系統的中醫執業者有權管理和配藥，因為中醫藥學的實踐與傳統醫學相結合。

臨床結果令人鼓舞，但由於樣本量小和缺乏比較組而受到限制。因此，根據確定的致病途徑，進行了抑制試驗，以確認該配方與病毒蛋白和其他結構的相互作用（圖。1），即病毒刺突蛋白與人血管緊張素轉化酶2（ACE2）的結合，從而使病毒可以侵入宿主細胞並複制[8，9]; 3CL蛋白酶是SARS-CoV-2中的關鍵酶，可裂解病毒多肽形成SARS-CoV-2複製的功能蛋白[10]; 促炎性細胞因子白介素（IL）-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α與致命的免疫炎症反應相關[[11]，[12]，[13]，[14]]。

圖1. NRICM101靶向嚴重急性呼吸系統綜合症冠狀病毒2（SARS-CoV-2）感染的潛在途徑的簡化示意圖。

NRICM101靶向SARS-CoV-2發病機制的選定機制：病毒刺突蛋白與人血管緊張素轉化酶2（ACE2），3CL蛋白酶的結合，可促進SARS-CoV-2複製，促炎性細胞因子白介素（IL）的產生-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α。

在這項從頭到尾的研究中，我們首先提供臨床環境中的真實詞語證據，然後是藥理學分析的結果，這些結果顯示病毒鼠疫形成，刺突蛋白/ ACE2相互作用，3CL蛋白酶活性和細胞因子產生。最後，配方和所有成分草藥均經過了高效液相色譜（HPLC）指紋驗證，以確保認證和標準化。

2.材料與方法

研究時間表和設計在 圖2。我們進行了臨床，藥理學以及標準化和質量控制研究，以評估NRICM101的有效性。人體研究的批准已從兩個醫療中心的機構審查委員會獲得批准（TSGHIRB編號C202005067和TCVGH-IRB編號CE20193A）。從每個患者獲得知情同意。在分析之前，對患者信息進行匿名和取消標識。

圖2. NRICM101的開發和臨床研究。

針對COVID-19開發NRICM101的流程圖。

2.1。臨床設置，參與者和數據分析

三軍總醫院和台中榮民綜合醫院是台灣疾病控制中心指定的52例重症COVID-19病例反應和隔離醫院之一。在2020年1月至2020年4月之間，有35名患者被送入兩個醫療中心。他們接受了對症治療和/或羥氯喹治療，直到其中13名患者在自願的基礎上並在護理小組的同意下轉為NRICM101。NRICM101每天給藥3次，每次100次 30毫升 飯後分鐘，直到出院。在台灣，研究期間的出院標準是呼吸道樣品的SARS-CoV-2連續3次陰性結果，每個樣品至少採集24個 相隔h（3 N）。不良事件（如果有）將以標準格式記錄。

床旁研究回顧了所有35例患者的人口統計學和臨床數據。我們使用描述性統計數據總結了NRICM101和非NRICM101組的樣本數據。排除2例（間歇性中醫治療，另一例接受靜脈免疫球蛋白治療）後，NRICM101組為12例，非NRICM101組為21例。3歲之前的年齡，性別，疾病嚴重程度，合併症，住院時間的分佈 呈現兩組中的N組。

2.2。配方的製備和組成

NRICM101湯是由兩個醫療中心的中藥店配製的，稍加修改了NRICM制定的COVID-19的TCM治療指南（補充1）中所包括的輕度病例的配方。它由10種草藥組成：黃耆（Scutellaria baicalensis，HA，18.75 g），心葉魚腥草（魚腥草，HC，18.75 g），桑葉（桑葉，NB，11.25 g），Saposhnikovia根（Saposhnikovia divaricata，NC，7.50 g）蒙古蛇瓜果實（Trichosanthes kirilowi​​i，ND，18.75 g），靛藍根（I藍NE，18.75 g），烤甘草根（甘草，NG，7.50 g），木蘭皮（厚朴），NK，11.25 g），薄荷藥草（門塔haplocalyx，NL，11.25 g）和Fineleaf Nepeta（Nepeta tenuifolia，NR，11.25 G）。對於病人's每日劑量，全套草藥和1 將1升水放入鍋爐中，煮沸並煮至湯減至300 毫升

2.3。NRICM101的HPLC分析

草藥材料（10種）是從當地有執照的草藥商店和Tri-Service General Hospital的TCM藥房獲得的。每個人（1.0 g）用水（30 毫升）在100 ℃ 為1 h並在1000離心 rpm 10 分鐘 所有樣品的上清液進一步通過0.22μmPTFE過濾器過濾。HPLC分析前，所有樣品均保存在-80℃。從兩個醫療中心的中藥店在不同時間（2020/04 / 03、2020 / 04 / 18、2020 / 04 / 19、2020 / 04/20）收集了十二批NRICM101湯。將該湯用冷凍乾燥機乾燥，得到15.9的粗提物。 ± 0.9 每300克 毫升 HPLC在配備ODS COSMOSIL 5C的Shimadzu Nexera-i LC-2040C 3D液相色譜儀（日本島津市）上進行_18歲-AR-II欄（4.6 毫米 × 250 mm）在40 ℃。在HPLC指紋分析中，流動相由DD水和0.3％磷酸和乙腈（ACN）組成，梯度條件如下：0.01–7.00 3分鐘–10％乙腈 7-15 最小10–20％ACN；15-35 最小20％ACN 35-50 最小20–35％乙腈; 50-60 最低35–100％乙腈 流動相流速和進樣量為1.0 mL / min和10 μL分別。

2.4。識別NRICM101中的組件

通過Diaion柱（HP-20，EtOH / H_2個O），C_18歲快速柱，並通過製備型HPLC進一步純化，得到17種化合物。所有分離的化合物的化學結構均通過NMR（1D和2D實驗）和HRMS進行測定，並與報導的數據進行比較。為了製備該湯的HPLC指紋圖譜的標準溶液，精確稱量每種化合物並溶於MeOH / DD H_2個O，濃度為1 毫克/毫升 所有測試溶液均通過0.22過濾 μ米過濾器使用前。分離株的進樣量為5 μL.

2.5。主要化合物的定量

在DMSO中以10的濃度製備主要化合物黃ical苷（Sigma-Aldrich，95％）的標準溶液 毫克/毫升 DD H中含50％ACN的儲備溶液_2個將O稀釋以獲得顯影液，包括0.015-1.0之間的七個濃度 毫克/毫升 將工作液通過0.22過濾 μHPLC進樣前使用m過濾器。應用線性回歸分析以通過積分峰和七個不同工作濃度下的濃度來實現線性。HPLC的分析條件與NRICM101湯的分析條件相同。

2.6。ACE2-穗蛋白抑制酶聯免疫吸附測定（ELISA）

進行了ACE2-spike蛋白抑制酶聯免疫吸附測定，以確定NRICM101阻斷ACE2和SARS-CoV-2穗受體結合域（RBD）蛋白（Sino Biological）之間相互作用的能力。簡而言之，微孔板板包被了尖峰RBD蛋白（0.2 μ克/孔）。用1％牛血清白蛋白（BSA）封閉後，將板用磷酸鹽緩衝鹽水和Tween洗滌劑（PBST）洗滌。然後，將5-，10-，20-，40-，80-，160-，320-，640-，1280-，2560-，5120倍稀釋的樣品添加到孔中，以與尖峰RBD蛋白反應。用PBST洗滌後，ACE2蛋白（0.2 μg / mL，Sino Biological）加入每個孔中進行孵育。接下來，使用與辣根過氧化物酶（HRP）綴合的兔抗His標籤抗體（Immunology consultants Laboratory，Inc。）進行檢測。最後，給每個孔3,3′，5,5'四甲基聯苯胺（TMB，SeraCare）用於顯色。用1終止反應後 N HCl，然後在OD 450下測量信號強度 nm（SPECTROstar Nano，BMG LABTECH）。

2.7。表面等離子體共振（SPR）

通過SPR（OpenSPR，Nicoyalife）進行與SARS-CoV-2的刺突RBD蛋白的結合反應。將重組刺突RBD蛋白稀釋至25 μ用PBS稀釋至g / mL，並通過NTA芯片（Nicoyalife）捕獲。在PBS中以不同的稀釋度對分析物進行測試，並將流速保持在20 μL / min進行分析。將NTA傳感器芯片再生為10 甘氨酸-HCl，pH2.2（Nicoyalife）。使用TraceDrawer軟件（Nicoyalife）分析結果。

2.8。3CL蛋白酶的抑制分析

該方法根據先前的研究進行了修改[15]，以20的音量進行 μL在384孔白色微孔板中（NUNC，羅斯基勒，丹麥）。簡要地，總共50 ng 3CL蛋白酶（最終濃度：75 nM）與樣品在反應緩衝液（25中孵育） mM Tris，100 氯化鈉，1 毫米EDTA，1 mM DTT，pH 7.3）在冰上放置30分鐘 分鐘 隨後，通過加入0.25來引發反應 μg蛋白酶熒光底物肽Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans（終濃度6μM），並在538處進行監測 355激發下的nm 37納米℃ 使用CLARIOstar酶標儀（BMG LABTECH，Ortenberg，Germany）進行1 H。通過下式計算抑制率[16]：抑制（％）= {1-[（S – S₀）/（CC₀）x 100 [C：1後對照（酶，緩衝液和底物）的熒光 h孵化；C₀：零時對照的熒光；S：1後樣品的熒光（酶，測試樣品溶液，緩衝液和底物） h孵化；小號₀：零時樣品的熒光]。重組SARS-CoV-2 3CL蛋白酶獲自Pharmtekx（台灣台北）。蛋白酶熒光底物肽購自Kelowna International Scientific Inc.（台灣新北市）。化學品獲自Sigma-Aldrich（密蘇里州聖路易斯）。

2.9。SARS-CoV-2感染和免疫熒光測定（IFA）

用各種稀釋度的樣品處理Vero E6細胞和SARS-CoV-2（台灣疾病預防控制中心的TCDC＃4）1 在37點 °然後將處理過的病毒添加到處理過的細胞中進行感染（MOI = 0.01）在37 °C 2天。用10％福爾馬林固定細胞，並用0.5％Triton X-100在PBS中透化。細胞用人類抗SARS-CoV-2染色 N蛋白單克隆抗體（由台灣台北中央研究院基因組研究中心的楊安穗博士提供）和山羊抗人IgG-Alexa Fluor 488（A11013，Invitrogen）。細胞核用DAPI（D1306，Invitrogen）染色。在免疫熒光顯微鏡下觀察並拍照。為了量化病毒感染，使用ImageXpress Micro XLS寬視野高內涵分析系統（Molecular Devices）獲取並分析圖像。為了進行細胞活力測試，將Vero E6細胞以不同的稀釋度於37℃處理1天。 °C.細胞活力通過細胞計數試劑盒8（CCK-8）確定。50％抑制濃度（IC₅₀）和50％的細胞毒性濃度（CC₅₀）由Prism軟件計算。

2.10。SARS-CoV-2菌斑減少中和試驗（PRNT）

用不同稀釋度的樣品處理Vero E6細胞和SARS-CoV-2（TCDC＃4）1 在37點 °C.將經處理的病毒添加至經處理的細胞中以在37℃進行病毒吸附 °C為1 H。去除病毒接種物，並用37％含1％甲基纖維素的培養基覆蓋細胞，以便在37℃下孵育4天 °C.將細胞用10％福爾馬林固定並用結晶紫染色。

2.11。細胞因子抑制試驗的抑制

5 × 10⁵在12孔培養板中培養MH-S鼠肺泡巨噬細胞（ATCC CRL-2019） H。在LPS（1 μg / mL）。IL-6和TNF-的產生α 使用商業化的ELISA試劑盒（R＆D Systems）測定細胞培養物中的糖原。

3.結果

3.1。臨床資料

表格1總結了33例患者（女性佔54.5％）的人口統計學和臨床特徵。參加者的平均年齡為40歲，其中30歲以下10歲，60歲以上8歲。大多數（87.9％）是輕度病例。根據美國疾病控制和預防中心住院建議的臨時指南，將疾病嚴重程度分為輕度，嚴重或嚴重。

表格1。患者的人口統計學和臨床特徵。

1個

：疾病的嚴重程度是根據美國疾病控制與預防中心提出的“確診冠狀病毒病患者的臨時臨床治療指南（COVID-19）”定義的。

2個

：除了NRICM101外，對出現心血管症狀的重症和重症患者也給予其他中醫治療。

3

：3 N表示患者呼吸道樣本連續三次測試為SARS-CoV-2陰性，並收集了樣本 ≧24 分開。

描述性統計顯示，NRICM101組（n = 12）的中位年齡為57歲，有合併症的年齡為8（66％），重症或危重病例為4（33.3％）。另一方面，那些沒有NRICM101（n = 21歲）的平均年齡為33歲，3歲（14.3％）合併症，無嚴重或嚴重病例。

接受對症護理的非NRICM101組達到了3 住院開始後第22天的中位數為N。NRICM101用於其餘在中位住院21.5天后仍未見好轉跡象的患者。3 干預後9天（中位數）觀察到N。

3.2。NRICM101的實驗室檢查結果

使用不同水平的NRICM101稀釋液作為表面等離子體共振（SPR）分析中的分析物，發現NRICM101對RBD蛋白的結合親和力是劑量依賴性的（圖3一種）。在ACE2峰值蛋白抑制酶聯免疫吸附測定（ELISA）中，NRICM101用IC中斷了SARS-CoV-2峰值對人ACE2受體的親和力₅₀稀釋128倍（0.41 毫克/毫升）（圖3B）。在SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性測定中，我們的評估表明NRICM101用IC對3CL蛋白酶表現出顯著的抑製作用₅₀稀釋248倍（0.22 毫克/毫升）（圖3C）。

圖3. NRICM101的藥理數據。

（A）通過SPR測定NRICM101對尖峰RBD蛋白的結合反應性。在PBS緩衝液中製備連續稀釋的湯劑（1 / 5X，1 / 10X，1 / 20X，1 / 40X，1 / 80X和1 / 160X）作為分析物。（B）在ACE2峰值蛋白抑制ELISA中，連續稀釋的NRICM101抑制了峰值RBD與ACE2的相互作用。根據未經NRICM101處理而標準化為穗狀RBD與ACE2相互作用的結合信號確定抑制百分比。（C）NRICM101抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的活性。該湯的系列稀釋液用於研究NRICM101對3CL蛋白酶的抑制活性。（D）免疫熒光測定法（IFA，上部）和噬斑減少中和試驗（PRNT，下部）的抗SARS-CoV-2數據。（E）IFA中CCK-8細胞活力和病毒感染的數據。（F，G）NRICM101抑制LPS誘導的小鼠肺泡巨噬細胞中IL-6和TNF-α的表達。數據表示為均值 ± SD來自三個獨立的實驗。50％抑制濃度（IC₅₀）和50％的細胞毒性濃度（CC₅₀）由Prism軟件計算。紅點表示抑制率為50％；表示為均值的數據 ± SD來自三個獨立的實驗。

NRICM101還顯示出減少SARS-CoV-2病毒生長的能力。在免疫熒光分析（IFA）中，通過SARS-CoV-2對病毒感染進行了定量 通過CCK-8測定法測定N蛋白表達和提取物的細胞毒性。NRICM101具有IC的優異抗SARS-CoV-2活性₅₀稀釋187倍（0.28 mg / mL）和CC₅₀稀釋30倍（1.77 毫克/毫升）。噬斑減少中和試驗（PRNT）進一步證明了其減少病毒生長的能力。與IFA數據類似，NRICM101可以阻止SARS-CoV-2斑塊的形成（圖3D，E）。

在細胞培養物中細胞因子的分析中，NRICM101表現出了對脂多醣刺激的鼠肺泡巨噬細胞通過IC檢測到的對IL-6和TNF-α分泌的抑製作用₅₀在128-（0.42 mg / mL）和45倍（1.18 毫克/毫升）分別稀釋（圖3F，G）。

3.3。單一草藥分析

分析了NRICM101的各個組件。首先，HC和NL在40倍稀釋液中顯示了阻斷ACE2和刺突蛋白之間結合的能力（1.33 （mg / mL）進行ACE2-spike蛋白抑制ELISA分析。特別是HC在40倍稀釋液中顯示出顯著的> 70％抑制率（圖4一種）。

圖4. NRICM101單一草藥的藥理數據。

（A）通過ACE2-刺突蛋白抑制ELISA確定刺突RBD與ACE2的相互作用。（B）SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性的抑制。（C）HA和HC的免疫熒光測定的抑制數據。（D）HA和HC的斑塊減少中和測試。（E，F）LPS誘導的鼠肺泡巨噬細胞中TNF-α和IL-6表達的抑制數據。紅點表示3CL蛋白酶活性的50％抑制。數據表示為均值 ± SD來自三個獨立的實驗。50％抑制濃度（IC₅₀）和50％的細胞毒性濃度（CC₅₀）由Prism軟件計算。

NRICM101中的草藥對3CL蛋白酶表現出優異的抑製作用。在這些草藥中，HA在5倍，10倍，20倍和40倍的稀釋液中表現出最有效的抑制活性，分別為101.2％，97.1％，92.0％和83.7％，表明HA是NRICM101活動的主要貢獻者（圖4B）。NR，NB，NK和NL也顯示出對3CL蛋白酶的強抑制活性，在20倍中為65.0％，54.3％，61.2％和68.2％（2.65 毫克/毫升）稀釋液。

選擇HC和HA進行進一步的抗病毒測定。在IFA中，HA的抗病毒活性較弱（IC₅₀以71倍稀釋度和CC₅₀稀釋17倍），但不用於HC（圖4C）。在PRNT中，HA阻止了SARS-CoV-2的噬菌斑形成，而HC則沒有（圖4D）。

在細胞因子抑制試驗中，分別分析了10種草藥中的每一種。稀釋20倍的HC和HA提取物能夠以大於50％的速率抑制TNF-α的產生。HA繼續以40倍稀釋抑制TNF-α和IL-6的產生，這表明HA可能是NRICM101活性的主要貢獻者（圖4E，F）。

3.4。分離出的化合物的鑑定和HPLC譜圖

最後，對NRICM101及其10種成分藥材進行HPLC指紋圖譜分析，以進行質量控制以及鉛化合物的分離和鑑定（圖5A，B）。十七種化合物，包括三種咖啡酰奎尼酸（CQA），3-CQA，4-CQA和5-CQA；四個槲皮素糖苷，槲皮素3-半乳糖苷，槲皮素3-葡糖苷，槲皮素3-鼠李糖苷和蘆丁; 兩種菊花C-葡糖苷，菊花6-C-葡糖苷-8-C-阿拉伯糖苷和菊花6-C-阿拉伯糖苷-8-C-葡糖苷；黃ical素型黃酮葡萄醣醛酸，黃ical素，黃cut苷和木糖苷；兩種降卵清苷葡糖苷酸，wogonoside和降冰激肽7-O-葡醣醛酸苷；黃烷酮糖苷，liquiritin；從中藥湯中成功分離出了鬼臼毒和醋苷。將分離出的化合物進一步指定為中藥湯的HPLC指紋圖譜。在比較HPLC指紋圖譜和前導化合物的相似性時，對12個不同批次NRICM101的質量評估顯示出高度的一致性。圖5C）。在12批次的NRICM101湯中，黃in苷（14）通過校準曲線進行定量（R^2個 = 0.9998），黃ical苷含量為2.3865 毫克/毫升

圖5. NRICM101湯，10種單一草藥和12批NRICM101的HPLC指紋圖譜。

（一種）。NRICM101湯的210、254、280液相色譜圖 納米1個：3-O-咖啡酰奎尼酸；2：表沒鐵蛋白；3：5-O-咖啡酰奎尼酸；4：4-O-咖啡酰奎尼酸；5：蘆丁 6：菊花6-C-阿拉伯糖苷-8-C-葡糖苷；7：脂蛋白 8：乙酰丙酮 9：槲皮素3-半乳糖苷；10：槲皮素3-葡萄糖苷；11：菊花6-C-葡糖苷-8-C-阿拉伯糖苷；12：黃cut素；13：槲皮素3-鼠李糖苷； 14：黃ical苷；15：諾沃戈寧7-O-葡醣醛酸；16：山梨糖苷；17：窩參皂甙 （B）。280種10種單一草藥的HPLC指紋圖譜 納米 HA：黃cut根（Scutellaria baicalensis）；HC：魚腥草（Houttuynia cordata）；NB：桑葉，NC：Saposhnikovia根（Saposhnikovia divaricata）；ND：蒙古蛇類水果（Trichosanthes kirilowi​​i）；NE：靛藍根（Isatis indigotica）；NG：蜜燒甘草根（甘草）；NK：木蘭皮（Magnolia officinalis）；NL：薄荷香草（Mentha haplocalyx）；NR：Fineleaf Schizonepeta Spike（Schizonepeta tenuifolia）。（C）。從兩個醫療中心的中藥店購買的12批湯劑的HPLC指紋圖譜在280 納米

4。討論

該研究證明了NRICM101抗COVID-19的抗病毒和抗炎作用。資料豐富的臨床數據表明，患者隔離21.5天沒有改善的跡象3 移至NRICM101後N天，無不良事件。在確證試驗中，NRICM101通過降低刺突蛋白的結合親和力，3CL蛋白酶活性和病毒生長表現出抗病毒作用。它似乎也抑制了肺泡巨噬細胞中IL-6和TNF-α的表達。

疾病嚴重程度，合併症和老年人是COVID-19的危險因素[17，18歲]。在我們的研究中，年齡較大，病情較重，並存疾病的患者主要集中在NRICM101組。他們是那些沒有達到3的人 在整個住院期間的21.5天中，處於正常狀態，如果病毒未得到充分控制，則可能已發展為更為嚴重的狀態。儘管樣本量，選擇偏倚和組間可比性均存在弱點，但我們的回顧性觀察數據強調了真實證據（RWE）的貢獻。RWE的使用在醫療保健環境中受到了越來越多的關注，例如製定指南，制定監管政策，支持臨床試驗設計或提供新的治療方法。在這個關鍵時刻，它具有巨大的潛力，使我們能夠將研究結果應用到COVID-19的治療開發中。

NRICM101由傳統上用於治療中醫理論中流行病患者的草藥組成，並且還證明了它們對抗各種病毒的能力[[19]，[20]，[21]，[22]，[23]，[24]]。我們的研究結果顯示，黃cut根（HA），魚腥草魚腥草（HC）和薄荷薄荷（NL）可能劑量依賴性地阻斷刺突蛋白/ ACE2相互作用，而五種草藥包括HA，NL，細葉荊芥（NR），木蘭皮（NK）和桑葉（NB）以劑量依賴性方式抑制3CL蛋白酶的活性。這些數據表明，這些草藥的配合有助於NRICM101的抗病毒活性。NRICM101的化學指紋圖譜表明，類黃酮是構成NRICM101的主要成分。從植物中分離出的類黃酮對冠狀病毒3CL蛋白酶具有抑制活性[16，[25]，[26]，[27]，[28]]，表明這些類黃酮可能是NRICM101的活性成分。另外，NRICM101的化學指紋圖譜表明黃ical苷是最豐富的組分，佔4.50％（715.95 毫克/15.9 g）NRICM101總乾重，其濃度也與NRICM101對SARS-CoV-2感染的抑制活性密切相關，因此，可作為NRICM101生物等效性質量控制的標誌。

新興證據表明，IL-6在細胞因子驅動的致命免疫炎症反應（稱為細胞因子風暴）的病理生理中起著至關重要的作用[29]。由於細胞因子風暴參與了嚴重COVID-19的發病機制，因此具有減輕IL-6和TNF-α潛能的療法可能會減緩疾病進展和隨後的死亡率[[30]，[31]，[32]]。此外，在嚴重COVID-19的患者中，支氣管肺泡灌洗液中發現了大量促炎性單核細胞衍生的巨噬細胞[29]。我們的結果表明，NRICM101及其組成成分的黃Ro根（HA）可顯著抑制鼠肺泡巨噬細胞中IL-6和TNF-α的分泌，這表明NRICM101具有預防COVID-19誘導的細胞因子風暴的潛力。黃ical苷是NRICM101和HA中的主要成分，據報導可抑制肺炎性細胞因子，包括IL-6，IFN-γ和TNF-α，並降低Th1 / Th2和Th17 / Treg的比率。黃ical苷通過下調RLRs信號通路顯示出這種能力，從而控制了甲型流感病毒的感染並改善了預後[33]。通過抑制炎症反應和淋巴細胞凋亡，它也證明了對微生物敗血症的保護作用[34]。簡而言之，它可能是NRICM101抗炎活性的主要成分。

現有的基於COCID-19患者的中藥配方包括蓮花清溫膠囊，清肺排毒湯，Maxinshigan Tang，華氏百度湯，金花清肝顆粒，宣肺百度湯等。據報導這些製劑具有抗病毒，抗炎和免疫調節作用[35，36]。在撰寫本文時，目前正在科學研究的唯一可用治療方法似乎可以縮短症狀恢復的時間，但在治療組和對照組之間，向嚴重病例的轉化率或病毒檢測結果並未顯示出差異[37]。儘管有一些常用成分，NRICM101與大多數這些配方的不同之處在於避免使用含有麻黃的麻黃，含有馬兜鈴酸的細辛細辛和礦物石膏。麻黃在傳統中藥中通常用於“清熱”，但發現使用麻黃具有重大的安全隱患[38，39]。馬兜鈴酸是已知的毒素，在許多國家/地區已禁止或限制含有它們的產品[40]。在不包含這些材料的情況下，NRICM101在臨床和體外均發揮了有益的作用，同時通過選擇基於植物的且安全使用的成分來確保安全性。

該研究的局限性包括樣本量小以及對潛在機制的評估有限。截至2020年5月31日，台灣報告了442例陽性病例，因此以較小的樣本量限制了我們的推論分析。其次，在現實世界中，我們在入院時就無法管理中醫或隨機分配治療/觀察組。需要進行更多調查，以探索NRICM101的可能作用和潛在機理，並確定草藥成分的最佳組成，以最大程度地發揮配方的功效。儘管NRICM101避免疾病發展的能力需要進一步驗證，但我們在台灣的經驗提出了一種多目標且潛在安全和有效的新藥候選物。

5.結論

研究中證實的NRICM101的抗病毒和抗炎作用表明它可用於抑制SARS-CoV-2入侵和增殖的機制。減輕COVID-19及其相關的社會負擔的緊迫性保證了用非常規的臥床試驗方法測得的該配方可能的貢獻。

作者貢獻

蘇義昌構想了這項研究，並對所有研究進行了監督。蘇宜昌，邱文飛，郭耀豪，蔡耿昌，魏文琦，廖家成，邱春棠，曾玉慧，林一玲，賈佳T，梁建榮和廖春-設計並進行了實驗，分析了數據並起草了手稿。林瑞珊（Sunny Jui-Shan Lin），黃以嘉（Yi-Chia），葉國明（Xu-Ming Yeh），林建榮（Chien-Jung Lin），蔡家宜（Chia-I Tsai）有助於數據的獲取和準確性。李申明，曾玉慧和李明勇為統計分析做出了貢獻。所有作者都同意對作品的各個方面負責

資金

這項工作得到了台灣衛生署的支持（109T88-05）。

CRediT作者貢獻聲明

蔡景昌：數據策劃，形式分析，調查，方法論，項目管理，軟件，寫作-原始草案，寫作-審查和編輯。黃以嘉：資源，驗證。Chia-Ching Liaw：數據策劃，形式分析，調查，方法論，寫作-原始草案，寫作-審查與編輯。蔡家宜：資源，驗證。邱春堂：形式分析，調查，方法論，寫作（原始草案），寫作（複習和編輯）。林建榮：資源，驗證。魏文Chi：形式分析，調查，方法論，寫作（原始草案），寫作（複習和編輯）。林瑞珊（Sunny Jui-Shan Lin）：方法論，資源，驗證。曾玉慧：數據策劃，形式分析，方法論，寫作-原始草案，寫作-審查與編輯。葉國明：資源，驗證。林義玲：形式分析，調查，方法論，寫作-原始草案。Jia-Tsrong Jan：形式分析，調查，方法論，寫作-原始草案。梁建鐘：形式分析，調查，撰寫-原始草案。廖純澈：形式分析，調查，撰寫-原草案。邱文飛：資金獲取，方法論，項目管理，監督，寫作-審查與編輯。郭耀浩：方法論，項目管理，寫作-審查與編輯。Lee Shen-Ming Lee：形式分析，方法論。李明勇：形式分析，方法論。Su Yi-Chang Su：概念化，資金獲取，資源，驗證，監督，寫作-審查和編輯。寫作-原始草案。梁建鐘：形式分析，調查，撰寫-原始草案。廖純澈：形式分析，調查，撰寫-原草案。邱文飛：資金獲取，方法論，項目管理，監督，寫作-審查與編輯。郭耀浩：方法論，項目管理，寫作-審查與編輯。Lee Shen-Ming Lee：形式分析，方法論。李明勇：形式分析，方法論。Su Yi-Chang Su：概念化，資金獲取，資源，驗證，監督，寫作-審查和編輯。寫作-原始草案。梁建鐘：形式分析，調查，撰寫-原始草案。廖純澈：形式分析，調查，撰寫-原草案。邱文飛：資金獲取，方法論，項目管理，監督，寫作-審查與編輯。郭耀浩：方法論，項目管理，寫作-審查與編輯。Lee Shen-Ming Lee：形式分析，方法論。李明勇：形式分析，方法論。Su Yi-Chang Su：概念化，資金獲取，資源，驗證，監督，寫作-審查和編輯。編輯。郭耀浩：方法論，項目管理，寫作-審查與編輯。Lee Shen-Ming Lee：形式分析，方法論。李明勇：形式分析，方法論。Su Yi-Chang Su：概念化，資金獲取，資源，驗證，監督，寫作-審查和編輯。編輯。郭耀浩：方法論，項目管理，寫作-審查與編輯。Lee Shen-Ming Lee：形式分析，方法論。李明勇：形式分析，方法論。Su Yi-Chang Su：概念化，資金獲取，資源，驗證，監督，寫作-審查和編輯。

競爭利益聲明

沒有任何。

致謝

我們感謝中央研究院農業生物技術研究中心的代謝組學核心設施提供的技術支持。